New Phytologist---SLAF-seq助力黄瓜广谱抗性基因STAYGREEN挖掘

蔬菜抗病性研究一直是育种工作者的主要研究方向，培育高抗、优质、高产品种更是更是育种家的目标。霜霉病、细菌性角斑病、真菌性炭疽病一直以来都是黄瓜中最为常见且危害较为严重的病害，因而探究黄瓜对这些病害的感病机理、挖掘持久、广谱抗性基因成为育种和植保研究者面临的最直接的问题。近日，国际知名期刊New Phytologist发表了威斯康星大学园艺系翁益群老师在黄瓜抗病研究中的最新成果，该研究基于百迈客SLAF-seq遗传图谱将抗病基因定位chr5，而后利用图位克隆、局部关联分析，确定了抗病基因为SGR。SGR为易感缺失型（loss-of-susceptibility）基因，在叶绿素降解途径中可以抑制活性氧和植物毒性分解代谢物过度积累，从而保持黄瓜宿主抗性。下面图谱君就为大家带来该文章的详细解读，以饕读者。

英文题目：STAYGREEN,STAY HEALTHY:a loss-of-susceptibility mutation in the STAYGREEN gene provides durable, broad-spectrum disease resistances for over 50 years of US cucumber production；

合作单位：威斯康星大学园艺系，河北农林科学院，北京农林科学院，上海交通大学等；

发表杂志：New Phytologist；

影响因子：7.43

材料与方法

1、定位群体：亲本黄瓜品种Gy14、WI2757、9930和True Lemon抗病性表现以及以这些亲本为基础构建的子代群体见下表。

注：DM（downy mildew）霜霉病；ALS（angular leaf spot）角斑病；AR（anthracnose）炭疽病

2、材料种植：对于DM抗性，G9RIL和WTRIL在5个环境下种植，其中4个环境下为开放自然发病，1个环境为可控环境下人工接菌，在1片真叶期接菌。对于ALS抗性，WTF23和G9RIL在4个环境下种植，均为可控环境下人工接菌。

3、表型考察：对于DM抗性，采用3种性状反映：黄变情况，yellowing (Yel)；坏死情况，collapsing (Col) ；总体表现，general impression (GI)；每个性状采用分级打分的方法衡量。接菌后10-14天开始观测表型，每隔1个星期观察1次表型，观察2-3周（作者以Rating time表示每次观测）。对于ALS抗性，只采用general impression (GI)反映，其中1个环境以抗/感为指标，其他环境抗性分级打分。

4、信息分析：遗传力估计、相关性分析采用R/LME4；QTL定位使用R/QTL，1.5-LOD确定置信区间；使用MEGA 7.0构建SGR类基因进化树；使用Haploview进行LD分析；局部关联分析使用 R/RRBLUP package。

5、分子实验：qPCR

主要结果

1、对接种DM病原体的G9RIL和WTRIL进行表型考察，发现子代群体并没有表现出明显的坏死形状，而在抗性材料中主要表现出黄化推迟的表型。在G9RIL群体中，虽然通过Yel、Col和GI性状来衡量抗感病情况，但发现Yel是DM是病害病症发展的主要组成部分，所以在后面的定位中主要采用Yel和GI两个性状衡量抗性等级（图1）。

图1 亲本及G9RIL群体DM抗病表现

2、方差分析发现存在显著的环境效应，所有QTL定位时均在单环境下进行。利用G9RIL对DM抗性进行定位，所有环境下均在chr5定位到相同QTL，该QTL与之前报道的dm1是同一位点。利用WTRIL群体的SLAF图谱，共定位到2个QTL，其中1个与dm1是共定位，另外在chr5上定位到1个QTL dm5.2（图2）。可以看出Gy14和WI2757可能存在共同抗性基础。

对ALS进行QTL定位，利用G9RIL群体在chr5定位到1个QTL（命名为psl），利用WTF23群体定位到3个QTL，其中1个为与psl共同定位的主效QTL，另外2个微效QTL psl1.1 和psl3.1（图3）。基于1.5-LDO的置信区间和联合定位结果发现，dm1与psl是有相同的定位区间，被认为是1个QTL（图4）。

图2 利用G9RIL和WTRIL群体对DM抗性定位结果

图3 利用G9RIL和WTRIL群体对ALS抗性定位结果

图4 联合定位分析结果显示dm1和psl为同一QTL

3、在初定位的基础上，对dm1和psl进行精细定位。首先开发了2个定位区间侧翼SSR，然后在375个G9RIL筛选到18个重组个体。因为Gy14只表现出中等的DM抗性，表型鉴定受环境影响较大，所以作者选取5个环境来考察这些重组个体的表型，以准确鉴定表型。在定位区间继续开发了9个多态标记对18个重组个体分型，鉴定到9类单体型，结合重组个体的DM抗性表型，将dm1定位在93.7 kb区间内。同时，鉴定重组个体的ALS抗性，发现ALS抗性表现与DM抗性是一致的，这也说明dm1和psl是相同的位点（图5）。

图5 dm1和psl的精细定位及BSA分析结果

注：a~c为精细定位过程，d、e为BSA

4、基于黄瓜9930基因组，在93.7kb的区间内共有12个基因（包含CsSGR，图5b），结合6个抗病材料和6个感病材料的重测序数据在定位区间内做类BSA分析，关联到1个SNP，而该SNP就在CsSGR的编码区，这说明CsSGR最有可能是dm1/psl的候选基因（图5d）。对Gy14、9930和WI2757 的CsSGR测序比对显示，在基因的323处存在1个SNP的变异，其中易感材料9930为A，抗性材料Gy14、WI2757为G，这与BSA的结果不谋而合，该SNP引起编码的氨基酸由谷氨酰胺突变为精氨酸。从而作者进一步确定了该基因为候选基因。

5、之前研究显示，CsSGR为炭疽病抗性位点cla的候选基因（也就是说CsSGR可能是一个抗霜霉病、角斑病、炭疽病的基因）。为验证这一结果，作者利用自然群体材料在97.5kb的范围对DM、AR、ALS作了局部关联分析，结果发现CsSGR基因的323处的SNP与3个性状显著相关，从而确定CsSGR为dm1/psl/cla（图6）。

图6 候选区域内DM、AR、ALS抗性的局部关联分析

6、在单子叶和双子叶植物中，SGR基因的结构是高度保守的。SGR基因家族可分为SGR和SGR-like（SGRL）2个亚族，作者对12个物种（单子叶、双子叶植物都有）的SGR的序列进行聚类分析，可以将这些基因成功分到SGR和SGR-like 两个进化分枝内（图7）。

对SGR基因的结构域分析显示，该基因含3个结构域，包括1个叶绿体转运肽结构域，1个SGR保守域，1个可变C末端结构域（图7b）。而上述结果中，CsSGR基因上的SNP突变就发生在SGR的保守域内（图7b），引起谷氨酰胺转化为精氨酸，氨基酸类型的改变使1个与α-helix连接的β-fold sheet缩短，该结构的变化使蛋白结构发生变化，从而可能引起叶绿素降解催化效率的改变（图8）。

图7 SGR基因家族分析和SGR结构域分析

图8 CsSGR在抗、感亲本中蛋白结构

7、既然CsSGR与黄瓜抗病性和叶绿素降解途径均相关，那么叶绿素降解途径和黄瓜的抗病性又存在什么关系呢？接下来，作者利用qPCR对CsSGR进行表达分析。亲本9930、Gy14、WI2757接种DM 5天，CsSGR表达量在3个材料中均提高，在接种7天时，CsSGR表达量在9930持续增加，而在Gy14、WI2757中开始减少（图9b），这也与9930（黄化）、Gy14（持绿）、WI2757（持绿）的表型是一致的（图9c）。接种ALS和AR后，也表现出同样的趋势。为了研究CsSGR在叶绿素降解途径的作用，作者对黄瓜叶绿素降解途径的9个基因在接种病原菌后的表达情况进行分析，最终发现叶绿素降解途径可能在CsSGR调控的DM抗性中发挥重要作用。

图9  9930、Gy14、WI2757接种DM后CsSGR的表达量变化及叶片持绿情况

8、结合之前研究发现，dm1/psl/cla（也即CsSGR）是来自黄瓜抗性材料PI 197087，为了调查dm1/psl/cla在自然群体中的分布情况，作者对152个黄瓜品种的CsSGR侧翼20kb的LD block进行进化树分析，发现19个美国品种中，9个抗性材料与PI 197087分在一个枝上，而另外10个易感材料被分在其他分支（图10），这也表明PI 197087的dm1/psl/cla区域在抗病育种经历了多样化选择。另外，由于CsSGR区域有着较小的LD，这就有利于通过杂交育种向其他材料中导入该区段。接下来，作者把734个育种系接种DM病原菌的抗性表型与CsSGR基因上SNP进行关联，单标记分析显示CsSGR基因232处的SNP（A--G）与抗性表型关联性最强，这不仅验证了CsSGR为dm1的候选基因，还可以通过鉴定该SNP而筛选抗、感材料，进而应用于标记辅助选择育种。

图10 根据CsSGR侧翼序列构建进化树

讨论

1、CsSGR是一个易感缺失性宿主抗性基因。

2、CsSGR通过调控叶绿素降解途径实现黄瓜多种病原菌抗性

图谱君点评

该研究基于经典的遗传图谱和图位克隆的方法，成功定位到了一个黄瓜广谱抗性基因。在抗病性研究中，抗性表型鉴定一个困难且重要的工作，因为植物感病状态易受环境影响，所以作者利用了3个子代群体并且每个群体均进行了多年多地点的抗性鉴定工作。同时，对每一种病原菌感染后的子代，采用了3种表型指标进行衡量，从而增强了表型检测的准确度，当然，这也大大增加了作者的工作量。不过，通过比较多年多点的定位结果，寻找共定位QTL，可以精准确定causing gene，增强结果的可信度。另外，结合自然群体材料对该基因2种等位基因进行了验证。本文也有不足之处，作者得到候选基因后，并没有对基因进行转基因、基因编辑等分子实验来验证基因功能；另外，前人已有多个研究对该基因位点进行了定位，也就是说该基因并非作者首次发现，这也对文章整体研究有一定的影响。

参考文献:

Wang Y, Tan J, Wu Z, et al. STAYGREEN, STAY HEALTHY: a loss-of-susceptibility mutation in the STAYGREEN gene provides durable, broad-spectrum disease resistances for over 50 years of US cucumber production[J]. New Phytologist, 2018.