Ago蛋白,基因编辑的新工具?|专访王皓毅

2019年7月30日，《细胞发现》 （Cell Discovery） 杂志在线发表了中科院动物研究所王皓毅团队和中科院北京生命科学研究院赵方庆团队的最新研究 [1] ，报道了两种来自人类胃肠道细菌的两种 Argonaute （Ago） 蛋白，它们可以在生理温度 （37℃） 下在 DNA 引导下实现对 DNA 单链和双链的切割。

这引发了人们的一系列问题：Ago 是否具有作为基因编辑工具的潜力？与目前当红的基因编辑工具 CRISPR 相比效果如何？这与曾经备受关注的韩春雨声称的NgAgo可做基因编辑工作有什么联系？

人类肠道菌群的Ago蛋白可切割DNA

Ago 蛋白是真核生物一类 RNA 介导的 RNA 内切酶。之前曾有研究表明，一些原核嗜热菌的同源 Ago 蛋白能够在 DNA 链引导的条件下切割 DNA [2，3，4] ，可能有发展为基因编辑工具的潜力。但这些酶只能在65°C以上的高温环境下工作，因此寻找在常温下工作的 Ago 蛋白是一项有吸引力的任务。

王皓毅团队和赵方庆团队将目光聚焦到人的肠道菌群。和之前报道的嗜热菌不同，这些细菌在人体中生活，因此它们的酶也应该在生理温度下有活性。

通过 PFAM 隐马可夫模型来识别已发表的人类肠道菌群中可能的Ago蛋白，研究人员发现来源于 Clostridium perfringens 的 CbAgo蛋白和来源于Intestinibacter bartlettii 的 IbAgo 蛋白在 PIWI 结构域中具有保守的催化四分体 （DEDD 或 DEDH） ，提示它们可以具有催化活性。

通过酶学实验，研究人员发现这两种 Ago 蛋白的确具有在 DNA 引导下进行 DNA 切割的能力。进一步的研究发现这两种 Ago 有一定的序列和结构偏好性，例如富集 AT 的 DNA 链相比富集 GC 的 DNA 链更容易被它们切割，具有超螺旋结构的 DNA 能够被切割，而线性化的 DNA 双链片段则不行 （图1） 。

图1：CpAgo和IbAgo具有底物偏好性。图片来源：参考文献[1]

相较于已经日趋成熟的 CRISPR 基因编辑系统，Ago 蛋白具有 DNA 介导，且蛋白分子小的优势。因此，寻找能在常温下进行基因编辑的 Ago 蛋白一直是领域里的一个研究方向。

2016年，河北科技大学的韩春雨课题组在《自然·生物技术》 （Nature Biotechnology） 杂志发表论文，报道在格氏嗜盐碱杆菌 （Natronobacterium gregoryi） 找到了一种能在生理温度下，在真核细胞内进行基因编辑的 Ago 蛋白，简称为 NgAgo。但其后由于没有实验室能够重复出该结果，韩春雨课题组撤回了该论文。

此后，陆续有研究报道 NgAgo 能够在大肠杆菌中增强同源重组，以及在斑马鱼中可以调低基因的表达 [5] ，但迄今尚无证据证明其在真核细胞中的基因编辑能力。

从0到1 的突破更难

那么，Ago 蛋白是否有成为基因编辑工具的潜力？

《细胞发现》一文的通讯作者王皓毅介绍说，他的课题组一直在尝试 CpAgo 和IbAgo 在真核细胞内的基因编辑活性，但目前还没有得到阳性的结果。另外，正如论文中所描述的，CpAgo 和 IbAgo 具有一定序列和拓扑结构的偏好性，这可能是由于这些 Ago 蛋白并没有解旋酶的活性。因此，王皓毅认为，目前的两个Ago 蛋白只是在体外表现出一定的切割 DNA 的活性，很难与已经非常高效的CRISPR 相比较。

王皓毅推测说，之前的实验表明 CpAgo 和 IbAgo 在超螺旋的 DNA 结构上有活性，这是因为超螺旋结构是有助于 DNA 双链解旋。而在细胞内，基因组处于动态变化过程，一些位点可能产生解螺旋，从而适合 Ago 蛋白切割。他的课题组在一些基因组位点上已经做了初步尝试，但目前还没有看到阳性结果。这可能是由于复杂的染色质结构，包括很多结合在 DNA 上的蛋白 复合物等干扰了 Ago 蛋白在体内的作用。

王皓毅同时也表示，虽然目前还没有证据证明 Ago 蛋白可以在体内发挥基因编辑的作用，但不能认为继续探索 Ago 的体内活性就没有意义。例如，CRISPR 有很多种类型，其中有一些是以单链 RNA 介导切割单链 DNA 的，这与 Ago 蛋白在体外的活性很相似。王皓毅指出，如果最初科学家挑选了这些 CRISPR 去研究，很可能得出的结论是 CRISPR 是切割单链 DNA 的。“不去发现，就永远不会知道会发现什么。”

当被问及 Ago 蛋白是否有作为基因编辑工具的潜力，王皓毅认为，这种潜力还是存在的。但当前首先要攻克的是，在体内能够得到可以重复的，让人确信的阳性结果。 “你必须得保证，尤其如果 （编辑） 效率低的话，你必须得保证你的检测是足够灵敏和特异的，从而确保检测的不是假阳性。” 王皓毅表示，只有在确认体内能够进行基因编辑的基础上，才可以进行各种优化，创造出适合科学家使用的分子工具。

他同时指出，如果进行优化是从1到100，“相对容易一些”，发现其体内确证的活性则是从0到1，才算是真正的突破，也 “更困难一些”。

“韩春雨并不能垄断Ago这个名字”

在本次发表的论文中，新发现的 CpAgo 和 IbAgo 与之前韩春雨论文报道的NgAgo 在进化聚类上比较接近 （图2） ，一些报道称这表明“韩春雨的思路并没有错”。

“做 Ago 的都成了拾韩春雨的牙慧了……” 看到上面的标题，王皓毅哭笑不得。“韩春雨并不能垄断 Ago 这个名字……这些标题也就是想蹭热度，是标题党吧。”

王皓毅指出他自己开始关注 Ago 作为一个潜在的基因编辑工具，“基本上是从2014年的那篇 Nature （论文） 开始的 [2] ，就是荷兰的那个团队，他们长期在做CRISPR 和 Ago 的相关研究工作”。五年前，荷兰瓦赫宁根大学的微生物学家John van der Oost 等人的研究发现，TtAgo 蛋白在高温下可以进行基因编辑。“从那个时间点开始，我相信我的很多同行，包括我自己，都开始探索这方面 （Ago作为基因编辑工具） 的可能性。”

“所以说，韩春雨做的事情，你也可以说是他的思路，当然这个思路并不是他独有的，这个思路是非常 obvious（显然）的，包括我们当时其实也在看另外一个常温的 Ago，只不过我们都没有看到阳性结果。” 王皓毅说。

另外，王皓毅表示，NgAgo 是高盐高碱环境下生活的古菌，而 CpAgo 和 IbAgo是人的共生菌，“也很难说和 NgAgo 有什么直接的关系”，更不能说明 NgAgo就可能有 DNA 切割活性。

值得一提的是，John van der Oost 团队和 Alexei Aravin 团队也在近期发表论文 [6，7] ，分别独立发现在常温下作用的 CbAgo，显示在常温下 Ago 系统也是微生物一种重要的防御机制。

图2：不同Ago蛋白的聚类分析。图片来源：参考文献[2]

1. Cao Y, Sun W, Wang J, et al. Argonaute proteinsfrom human gastrointestinal bacteria catalyze DNA-guided cleavage of single-anddouble-stranded DNA at 37° C[J]. Cell Discovery, 2019, 5(1): 38.

2. Swarts D C, Jore M M, Westra E R, et al. DNA-guidedDNA interference by a prokaryotic Argonaute[J]. Nature, 2014, 507(7491): 258.

3. Swarts D C, Hegge J W, Hinojo I, et al. Argonauteof the archaeon Pyrococcus furiosus is a DNA-guided nuclease that targetscognate DNA[J]. Nucleic acids research, 2015, 43(10): 5120-5129.

4. Zander A, Willkomm S, Ofer S, et al.Guide-independent DNA cleavage by archaeal Argonaute from Methanocaldococcusjannaschii[J]. Nature microbiology, 2017, 2(6): 17034.

5. Qi J, Dong Z, Shi Y, et al. NgAgo-based fabp11agene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish[J]. Cell research,2016, 26(12): 1349.

6. Hegge J W, Swarts D C, Chandradoss S D, et al.DNA-guided DNA cleavage at moderate temperatures by Clostridium butyricumArgonaute[J]. Nucleic acids research, 2019, 47(11): 5809-5821.

7. Kuzmenko A, Yudin D, Ryazansky S, et al. Programmable DNA cleavage byAgo nucleases from mesophilic bacteria Clostridium butyricum and Limnothrixrosea[J]. Nucleic acids research, 2019, 47(11): 5822-5836.

制版编辑 | 皮皮鱼